Karbohidrat merupakan komponen utama dalam suatu makanan yang merupakan sumber energi yang utama bagi setiap organisme hidup. Dalam sel-sel tubuh, karbohidrat mengalami berbagai proses kimia. Maka proses inilah yang kemudian mempunyai peranan penting dalam tubuh kita. Proses-proses yang dialami oleh unsur-unsur makanan setelah dicerna dan diserap disebut dengan metabolisme intermediet. Metabolisme intermediet ini mencakup bidang luas yang tidak hanya proses metabolik yang dialami oleh masing-masing molekul saja, tetapi juga interelasi dan mekanisme yang mengatur arus metabolit untuk dapat melewati proses-proses atau tahapan-tahapan tersebut.
Proses metabolisme itu kemudian digolongkan menjadi 3 macam, yaitu:
1. Anabolime (penyatuan/pembentukan)
Anabolisme merupakan serangkaian reaksi kimia yang substrat awalnya adalah molekul kecil dan produk akhirnya adalah molekul besar atau dengan kata lain reaksi yang bertujuan untuk penyusunan atau sintesis molekul. Pada makalah ini proses anabolisme yang dibahas adalah glukoneogenesis, glikogenesis dan fotosintesis.
2. Katabolisme (pemecahan)
Katabolisme merupakan serangkaian reaksi kimiayang substrat awalnya adalah molekul besar dan produk akhirnya molekul kecil atau dengan kata lain reaksi yang bertujuan untuk pembongkaran atau penguraian suatu molekul. Pada makalah ini proses katabolisme yang dibahas adalah glikolisis asam piruvat.
3. Amfibolisme (persimpangan)
Reaksi ini memiliki lebih dari satu fungsi dan terdapat pada persimpangan metabolisme sehingga bekerja sebagai penghubung antara reaksi anabolisme dan reaksi katabolisme. Contoh dari reaksi ini adalah siklus asam sitrat.
Beberapa metabolisme yang terjadi pada biosintesis karbohidrat
A. GLIKOGENESIS
Glikogen adalah bentuk karbohidrat yang utama di dalam tubuh hewan dan merupakan polimer α-glukosa yang bercabang. Glikogenesis adalah proses sintesis dari glukosa menjadi glikogen. Terjadi bila jumlah glukosa itu berlebih sehingga sebagian glukosa diubah menjadi glikogen. Glikogenesis terutama terjadi pada hepar dan otot.
B. GLUKONEOGENESIS
Adalah proses pembentukan D-glukosa dari prekursor yang bukan karbohidrat. Karena prekursor yang digunakan bukan karbohidrat, maka sumber karbonnya adalah sejumlah prekursor glukogenik yang terutama berasal dari asam amino-L, laktat atau gliserol. Proses ini terjadi jika makanan yang dimakan tidak cukup mengandung D-glukosa yang dapat menyebabkan turunnya kadar glukosa darah. D-glukosa harus dibentuk karena senyawa ini penting untuk fungsi sebagian besar sel dan mutlak dibutuhkan oleh sistem syaraf dan eritrosit.
Jalur metabolisme ini terjadi terutama di hati dan ginjal, tetapi glukoneogenesis secara fisiologis tidak berarti dalam otot karena otot tidak mempunyai enzim glukosa 6-fosfatase yang mengubah glukosa 6-fosfat menjadi glukosa untuk dilepaskan ke darah.
C. FOTOSINTESIS
Fotosintesis adalah suatu proses biokimia yang dilakukan tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri untuk memproduksi energi terpakai (nutrisi) dengan memanfaatkan energi cahaya. Hampir semua makhluk hidup bergantung dari energi yang dihasilkan dalam fotosintesis. Akibatnya fotosintesis menjadi sangat penting bagi kehidupan di bumi. Fotosintesis juga berjasa menghasilkan sebagian besar oksigen yang terdapat di atmosfer bumi. Organisme yang menghasilkan energi melalui fotosintesis (photos berarti cahaya) disebut sebagai fototrof.. Fotosintesis merupakan salah satu cara asimilasi karbon karena dalam fotosintesis karbon bebas dari CO2 diikat (difiksasi) menjadi gula sebagai molekul penyimpan energi. Cara lain yang ditempuh organisme untuk mengasimilasi karbon adalah melalui kemosintesis, yang dilakukan oleh sejumlah bakteri belerang.
D. GLIKOLISIS ASAM PIRUVAT
Kata glikolisis berarti “menguraikan gula”. Glikolisis adalah reaksi pemecahan atau pembongkaran(katabolisme) satu molekul glukosa (6C) menjadi dua molekul senyawa piruvat (3C) yang berlangsung di dalam sitosol. Glikolisis merupakan reaksi katabolisme (pembongkaran). Dalam glikolisis, glukosa mengalami pembongkaran menjadi senyawa - senyawa-antara (intermediet) dengan dibantu enzim, lalu akan dibentuk piruvat atau laktat sesuai jalur glikolisisnya atau kandungan oksigennya.
DAFTAR PUSTAKA
Jawetz,M.&Adelberg, 1996, Mikrobiologi Kedokteran,18-19, EGC, Jakarta
Montgomery, Conway, Spector, 1993, Biokimia, , Binarupa Aksara, Jakarta
Jumat, 03 Juli 2009
Kamis, 02 Juli 2009
Elektroforesis
A. TUJUAN
Mempelajari dan mengetahui mekanisme elektroforesis.
B. PENDAHULUAN
Elektroforesis merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis dapat berlangsung dalam beberapa tipe berdasarkan medianya yaitu media gel dan media paper. Elektroforesis ini juga berguna dalam kehidupan manusia, misalnya : penentuan kadar kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma dan lain-lain. Elektroforesis juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul molekul berdasarkan muatannya.
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Secara metematis pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar bahan yang diamati dan kondisi lingkungan:
F adalah gaya Lorentz
q adalah muatan yang dibawa oleh objek
E adalah medan listrik
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.
Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi.
Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun verikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary.
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transport fisik zat terlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat ion,, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan.
Lintasan yang ditempuh oleh partikel yang bermuatan sesuai dengan :
d = U t e = UtV q k L
dimana V = Tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U = Mobilitas ion pada saat t, q = Luas penampang dan d = Lintasan yang ditempuh.
Peralatan dan Metodologi
Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit. Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat ionik juga telah dikembangkan.
C.Tipe-tipe Elektroforesis
1. PAPER ELECTROPHORESIS
Paper electrophoresis digunakan untuk memisahkan campuran molekul bermuatan kecil. Selembar kertas saring dibasahi dengan larutan buffer untuk mengontrol pH direntangkan antara dua elektroda. Satu tetes campuran yang akan dianalisis ditempatkan pada satu ujung kertas dan listrik dialirkan, Setelah molekul molekul berpindah pada jangka waktu tertentu, kertas dipindahkan dikeringkan dan diwarnai dengan pewarna yang mewarnai substansinya untuk dianalisa(diperiksa). Setiap jenis molekul bermuatan pada campuran(mixtura) akan berpindah pada jarak tertentu baik ke anoda maupun ke katoda tergantung pada muatan dimensi dan akan nampak sebagai titik pada kertas dengan posisi yang baru. Biasanya titik tersebut akan diidentifikasi dengan perbandingan dengan suatu standar yang juga di tempatkan pada kertas yang sama. (Mathew,1990).
· Pemisahan Asam Amino dengan Elektroforesis kertas
Contoh 3 asam amino: asam aspartat, histidin dan lisin. Elektroforesis pada tegangan potensial rendah biasanya tidak digunakan untuk memisahkan senyawa dengan berat molekul rendah disebabkan oleh difusi, tetapi lebih mudah untuk mengilustrasikan hubungan antara muatan dan pH dengan asam amino daripada dengan protein atau makromolekul lainnya.
Pada pH 7,6, histidin akan membawa muatan neto, asam aspartat akan menjadi bermuatan negatif (titik isoelektrik 2,77), dan lisin akan menjadi bermuatan positif (titik isoelektrik : 9,74). Pada titik isoelektrik terdapat kesetimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion, dan kation.
3 asam amino ini dapat dipisahkan dengan cepat dengan elektroforesis. Glukosa yang merupakan sebuah molekul yang tidak bermuatan, seharusnya elektro-osmosis yang termasuk campuran untuk memeriksa beberapa gerakan asal.
Metodenya adalah setetes larutan dari campuran asam amino, dikeringkan pada kertas, kertas dibasahi dengan buffer pada PH tertentu dan ditempatkan diantara lempengan pendingin. Ujung kertas dicelupkan ke dalam kompartemen elektroda. Penggunaan medan listrik dengan aliran listrik searah memisahkan asam amino berdasarkan muatan listrik total pada PH yang dipergunakan. Asam amino yang bersiat sebagai kation pada PH tersebut akan bermigrasi menuju katoda atau kutub negatif. Asam amino yang bersifat anion akan bergerak menuju anoda atau kutub positif. Pada akhir proses, kertas dikeringkan , disemprot dengan ninidrin dan panaskan yang memperlihatkan letak asam amino, dan diidentifikasikan dengan posisi asam amino yang telah diketahui, sebagai marker.
Gambar dua macam sistem elektroforesis kertas
Gambar Pemisahan Asam Amino pada Elektroforesis Kertas
2. GEL ELECTROPHORESIS (Elektroforesis Gel)
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam kandungan gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis).
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Dengan kata lain gel poliakrilamid dapat digunakan pada berbagai jenis protein dan asam nukleat.
Gambar Reaksi Pembentukan Gel Poliakrilamid
SDS gel elektroforesis
Sistem elektroforesis gel SDS digunakan untuk memutuskan dan mengkarakterisasi nomor dan ukuran rantai protein atau rantai protein subunit di dalam suatu persiapan protein. Pada dasarnya persiapan protein ini dilakukan dengan adanya tiol yang larut (R-SH, contohnya β-mercaptoethanol) dan SDS. Di bawah kondisi ini, R-SH mereduksi semua ikatan disulfida di dalam protein, yang mana detergen SDS mengikat semua wilayah protein dan menguraikan semua interaksi intramolekuler protein. Hasil ini dalam pengacauan total protein dan pengacauan hubungan antar subunit dan kemudian membawa hasil SDS, rantai polipeptida anionik tinggi. Rantai protein anionic yang terdenaturasi kemudian terurai secara elekroforesik dalam lingkungan buffer yang mengandung tiol dan SDS serta gel poliakrilamid konsentrasi tinggi. Tiol dan SDS mempertahankan posisi terdenaturasi dari protein atau subunit protein. Ikatan SDS pada protein membangkitkan muatan anionic yang konstan ke perbandingan masa untuk seluruh rantai protein yang terurai sementara gel dengan konsentrasi tinggi membangkitkan penyaring molecular, dimana viskositas dan ukuran pori dari gel menentukan pergerakan. Sebagai hasilnya pergerakan yang relative dari tiap anionic rantai polipeptida yang terdenaturasi adalah fungsi log dari bobot molekul rantai polipeptida.
Sistem gel SDS mudah dan bermanfaat sebagai alat elektroforesis gel kuantitatif dan kualitatif. Secara spesifik, persiapan protein murni dapat dianalisis homogenitasnya, hal ini untuk protein yang hasil ikatan selama pewarnaanya sedikit. Dengan kata lain protein murni dapat dianalisis jumlah dan ukuran dari subunit molekularnya.
Gambar Penguraian Protein menggunakan Tiol dan SDS
Kapiler elektroforesis gel
Kapiler elektroforesis gel adalah suatu elektroforesis gel yang mana dipakai sebagai alat utama dalam biokimia untuk tiga dasawarsa. Polimer gel digunakan untuk memisahkan makro molekul untuk ukuran yang sesuai biasanya dipakai untuk gel kimia dimana rantai tersebut mengalami ikatan silang oleh ikatan kimia.
Gel kimia sulit meresap ke pipa kapiler ketika ada penghalang sehingga gel secara fisik yang mana polimer linier yang sederhana biasanya berlilitan. Gel fisik dapat diresap dan dimuat lagi untuk membuat kapilari baru untuk masing-masing pemisahan.
Makromolekul dipisahkan dengan cara penyaringan yang mana molekul lebih kecil bermigrasi lebih cepat dari molekul yang lebih besar melalui jarring-jaring polimer berlilitan. Color Plate 25 menunjukkan bagian dari DNA setelah dianalisis dimana campuran fluorescence labeled fragmen dengan lebih dari 400 nukleotida dipisahkan pada sebuah kapiler yang mengandng 6 % poliakrilamid DNA dengan 30 nukleotida memiliki perpindahan 9 menit dan DNA dengan 30 nukleotida memiliki waktu migrasi 34 menit ujung nukleotida pada setiap fragmen yang dilabeli dengan setengah fluorescent label yang mana masing-masing dideteksi oleh fluorescence pada 2 panjang gelombang kombinasi dari 2 label dan 2 panjang glombang mengikuti sebuah penetapan spesifik untuk masing-masing dari 4 molekul nukleotida yang mungkin.
Contoh proses elektroforesis pada DNA
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.
Aplikasi Metode Elektroforesis
Elektroforesis digunakan pada saat:
1. Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell
2. Elektroforesis selalu digunakan untuk menentukan komposisi protein suatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbedaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang kedelai dan pekatan protein gandum yang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk menentukan kadar kemurnian suatu protein.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bermuatan tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein yang diketahui berat molekulnya. Protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
3. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
4. Kemurnian protein dinilai oleh elektroforesis gel poliakrilamid , metode yang digunakan untuk menentukan kemurnian suatu protein menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (polyacrylamide gel elektrophoresis). Dimana elektroforesis memisahkan biomolekul – biomolekul bermuatan berdasarkan laju migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik.
5. Untuk menganalisis protein plasma dalam darah. Di dalam protein plasma terdapat banyak jenis elektroforesis , yang masing – masing menggunakan medium penopang / penunjang yang berbeda. Di laboratorium klinik, selulosa asetat digunakan secara luas sebagai medium penunjang. Pada pemakaian bahan ini protein plasma dapat dipisah- pisahkan, setelah pemulasan , mejadi lima pita , yang masing- masing dinamai fraksi albumin α1,α2,β , dan γ.
Penutup
Kesimpulan
ü Elektroforesis merupakan metode yang digunakan untuk penentuan kadar kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma, juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.
ü Elektroforesis mempunyai berbagai tipe, antara lain: Elektroforesis Gel dan Elektroforesis Paper
Daftar Pustaka
Davidson, Victor. L. , Donald B. S ,1999, Biochemistry 4th Edition, Lippincott Williams and Walkins, Philadelphia, USA
Mathew, Christopher K., 1990, Biochemistry, 54-57, The Benjamin/ Cummings, California
Mayes, Peter .A , 1993, Biokimia, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Moran, Laurence A., Scrimgeur, K Gray, 1994, Biochemistry 2nd Edition, Neil Patterson Publisher/ Prentice Hall, Inc., UK
Mempelajari dan mengetahui mekanisme elektroforesis.
B. PENDAHULUAN
Elektroforesis merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis dapat berlangsung dalam beberapa tipe berdasarkan medianya yaitu media gel dan media paper. Elektroforesis ini juga berguna dalam kehidupan manusia, misalnya : penentuan kadar kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma dan lain-lain. Elektroforesis juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul molekul berdasarkan muatannya.
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik. Secara metematis pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar bahan yang diamati dan kondisi lingkungan:
F adalah gaya Lorentz
q adalah muatan yang dibawa oleh objek
E adalah medan listrik
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.
Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan akibat gravitasi.
Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun verikal dan interferensi anomaly paling kecil pada boundary.
Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transport fisik zat terlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat ion,, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan.
Lintasan yang ditempuh oleh partikel yang bermuatan sesuai dengan :
d = U t e = UtV q k L
dimana V = Tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U = Mobilitas ion pada saat t, q = Luas penampang dan d = Lintasan yang ditempuh.
Peralatan dan Metodologi
Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit. Arus searah digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina. Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat ionik juga telah dikembangkan.
C.Tipe-tipe Elektroforesis
1. PAPER ELECTROPHORESIS
Paper electrophoresis digunakan untuk memisahkan campuran molekul bermuatan kecil. Selembar kertas saring dibasahi dengan larutan buffer untuk mengontrol pH direntangkan antara dua elektroda. Satu tetes campuran yang akan dianalisis ditempatkan pada satu ujung kertas dan listrik dialirkan, Setelah molekul molekul berpindah pada jangka waktu tertentu, kertas dipindahkan dikeringkan dan diwarnai dengan pewarna yang mewarnai substansinya untuk dianalisa(diperiksa). Setiap jenis molekul bermuatan pada campuran(mixtura) akan berpindah pada jarak tertentu baik ke anoda maupun ke katoda tergantung pada muatan dimensi dan akan nampak sebagai titik pada kertas dengan posisi yang baru. Biasanya titik tersebut akan diidentifikasi dengan perbandingan dengan suatu standar yang juga di tempatkan pada kertas yang sama. (Mathew,1990).
· Pemisahan Asam Amino dengan Elektroforesis kertas
Contoh 3 asam amino: asam aspartat, histidin dan lisin. Elektroforesis pada tegangan potensial rendah biasanya tidak digunakan untuk memisahkan senyawa dengan berat molekul rendah disebabkan oleh difusi, tetapi lebih mudah untuk mengilustrasikan hubungan antara muatan dan pH dengan asam amino daripada dengan protein atau makromolekul lainnya.
Pada pH 7,6, histidin akan membawa muatan neto, asam aspartat akan menjadi bermuatan negatif (titik isoelektrik 2,77), dan lisin akan menjadi bermuatan positif (titik isoelektrik : 9,74). Pada titik isoelektrik terdapat kesetimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion, dan kation.
3 asam amino ini dapat dipisahkan dengan cepat dengan elektroforesis. Glukosa yang merupakan sebuah molekul yang tidak bermuatan, seharusnya elektro-osmosis yang termasuk campuran untuk memeriksa beberapa gerakan asal.
Metodenya adalah setetes larutan dari campuran asam amino, dikeringkan pada kertas, kertas dibasahi dengan buffer pada PH tertentu dan ditempatkan diantara lempengan pendingin. Ujung kertas dicelupkan ke dalam kompartemen elektroda. Penggunaan medan listrik dengan aliran listrik searah memisahkan asam amino berdasarkan muatan listrik total pada PH yang dipergunakan. Asam amino yang bersiat sebagai kation pada PH tersebut akan bermigrasi menuju katoda atau kutub negatif. Asam amino yang bersifat anion akan bergerak menuju anoda atau kutub positif. Pada akhir proses, kertas dikeringkan , disemprot dengan ninidrin dan panaskan yang memperlihatkan letak asam amino, dan diidentifikasikan dengan posisi asam amino yang telah diketahui, sebagai marker.
Gambar dua macam sistem elektroforesis kertas
Gambar Pemisahan Asam Amino pada Elektroforesis Kertas
2. GEL ELECTROPHORESIS (Elektroforesis Gel)
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam kandungan gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis).
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Dengan kata lain gel poliakrilamid dapat digunakan pada berbagai jenis protein dan asam nukleat.
Gambar Reaksi Pembentukan Gel Poliakrilamid
SDS gel elektroforesis
Sistem elektroforesis gel SDS digunakan untuk memutuskan dan mengkarakterisasi nomor dan ukuran rantai protein atau rantai protein subunit di dalam suatu persiapan protein. Pada dasarnya persiapan protein ini dilakukan dengan adanya tiol yang larut (R-SH, contohnya β-mercaptoethanol) dan SDS. Di bawah kondisi ini, R-SH mereduksi semua ikatan disulfida di dalam protein, yang mana detergen SDS mengikat semua wilayah protein dan menguraikan semua interaksi intramolekuler protein. Hasil ini dalam pengacauan total protein dan pengacauan hubungan antar subunit dan kemudian membawa hasil SDS, rantai polipeptida anionik tinggi. Rantai protein anionic yang terdenaturasi kemudian terurai secara elekroforesik dalam lingkungan buffer yang mengandung tiol dan SDS serta gel poliakrilamid konsentrasi tinggi. Tiol dan SDS mempertahankan posisi terdenaturasi dari protein atau subunit protein. Ikatan SDS pada protein membangkitkan muatan anionic yang konstan ke perbandingan masa untuk seluruh rantai protein yang terurai sementara gel dengan konsentrasi tinggi membangkitkan penyaring molecular, dimana viskositas dan ukuran pori dari gel menentukan pergerakan. Sebagai hasilnya pergerakan yang relative dari tiap anionic rantai polipeptida yang terdenaturasi adalah fungsi log dari bobot molekul rantai polipeptida.
Sistem gel SDS mudah dan bermanfaat sebagai alat elektroforesis gel kuantitatif dan kualitatif. Secara spesifik, persiapan protein murni dapat dianalisis homogenitasnya, hal ini untuk protein yang hasil ikatan selama pewarnaanya sedikit. Dengan kata lain protein murni dapat dianalisis jumlah dan ukuran dari subunit molekularnya.
Gambar Penguraian Protein menggunakan Tiol dan SDS
Kapiler elektroforesis gel
Kapiler elektroforesis gel adalah suatu elektroforesis gel yang mana dipakai sebagai alat utama dalam biokimia untuk tiga dasawarsa. Polimer gel digunakan untuk memisahkan makro molekul untuk ukuran yang sesuai biasanya dipakai untuk gel kimia dimana rantai tersebut mengalami ikatan silang oleh ikatan kimia.
Gel kimia sulit meresap ke pipa kapiler ketika ada penghalang sehingga gel secara fisik yang mana polimer linier yang sederhana biasanya berlilitan. Gel fisik dapat diresap dan dimuat lagi untuk membuat kapilari baru untuk masing-masing pemisahan.
Makromolekul dipisahkan dengan cara penyaringan yang mana molekul lebih kecil bermigrasi lebih cepat dari molekul yang lebih besar melalui jarring-jaring polimer berlilitan. Color Plate 25 menunjukkan bagian dari DNA setelah dianalisis dimana campuran fluorescence labeled fragmen dengan lebih dari 400 nukleotida dipisahkan pada sebuah kapiler yang mengandng 6 % poliakrilamid DNA dengan 30 nukleotida memiliki perpindahan 9 menit dan DNA dengan 30 nukleotida memiliki waktu migrasi 34 menit ujung nukleotida pada setiap fragmen yang dilabeli dengan setengah fluorescent label yang mana masing-masing dideteksi oleh fluorescence pada 2 panjang gelombang kombinasi dari 2 label dan 2 panjang glombang mengikuti sebuah penetapan spesifik untuk masing-masing dari 4 molekul nukleotida yang mungkin.
Contoh proses elektroforesis pada DNA
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.
Aplikasi Metode Elektroforesis
Elektroforesis digunakan pada saat:
1. Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell
2. Elektroforesis selalu digunakan untuk menentukan komposisi protein suatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbedaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang kedelai dan pekatan protein gandum yang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan. Elektroforesis dapat juga digunakan untuk menentukan kadar kemurnian suatu protein.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bermuatan tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein yang diketahui berat molekulnya. Protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
3. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
4. Kemurnian protein dinilai oleh elektroforesis gel poliakrilamid , metode yang digunakan untuk menentukan kemurnian suatu protein menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE (polyacrylamide gel elektrophoresis). Dimana elektroforesis memisahkan biomolekul – biomolekul bermuatan berdasarkan laju migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik.
5. Untuk menganalisis protein plasma dalam darah. Di dalam protein plasma terdapat banyak jenis elektroforesis , yang masing – masing menggunakan medium penopang / penunjang yang berbeda. Di laboratorium klinik, selulosa asetat digunakan secara luas sebagai medium penunjang. Pada pemakaian bahan ini protein plasma dapat dipisah- pisahkan, setelah pemulasan , mejadi lima pita , yang masing- masing dinamai fraksi albumin α1,α2,β , dan γ.
Penutup
Kesimpulan
ü Elektroforesis merupakan metode yang digunakan untuk penentuan kadar kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma, juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.
ü Elektroforesis mempunyai berbagai tipe, antara lain: Elektroforesis Gel dan Elektroforesis Paper
Daftar Pustaka
Davidson, Victor. L. , Donald B. S ,1999, Biochemistry 4th Edition, Lippincott Williams and Walkins, Philadelphia, USA
Mathew, Christopher K., 1990, Biochemistry, 54-57, The Benjamin/ Cummings, California
Mayes, Peter .A , 1993, Biokimia, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Moran, Laurence A., Scrimgeur, K Gray, 1994, Biochemistry 2nd Edition, Neil Patterson Publisher/ Prentice Hall, Inc., UK
Welcome
Selamat Datang di blog Pribadiku
Di dalam blog ini menyediakan seputar kehidupan sehari hari artis.....
Di dalam blog ini menyediakan seputar kehidupan sehari hari artis.....
Langganan:
Postingan (Atom)
